磷超標(biāo)是造成水體富營養(yǎng)化的主要原因之一.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)總磷濃度超過0.1 mg · L-1(磷作為限制因素，mTN ∶ mTP>15 ∶ 1)，藻類會過度繁殖;一般情況下，總磷濃度超過0.02 mg · L-1就有可能導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化. 由于水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重破壞了人類賴以生存的自然環(huán)境，威脅著人類的健康.常規(guī)的生化處理工藝效率低，不能從根本上解決問題.近些年，微生物除磷工藝的研究得到了迅速發(fā)展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等.為實現(xiàn)微生物除磷工藝的有效實施，篩選出除磷能力較強(qiáng)的聚磷微生物是首要目標(biāo).此外，考慮到聚磷微生物對磷的吸收是一個厭氧釋磷、好氧吸磷的過程，有必要考察聚磷微生物對溶氧的響應(yīng). 同時，微生物聚磷過程會受有機(jī)質(zhì)分子大小、pH等的影響. 因此，考察特定微生物在不同理化條件下的生長情況和除磷特性是實現(xiàn)微生物除磷機(jī)理研究及其在工程應(yīng)用的前提條件.
為獲得除磷能力較強(qiáng)的微生物種質(zhì)資源，自聚磷菌首次被分離以來，至今已有多種具備聚磷能力的微生物被篩選出來.多項研究表明，產(chǎn)堿桿菌屬細(xì)菌(Alcaligenes sp.)具備這方面的能力. 此外，腸桿菌(Enterobacteriaceae)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus)Accumulibacter、變形菌(Alphaprotenbacteria)等也是常見的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物. 在此基礎(chǔ)上，人們又開展了大量關(guān)于溶氧對聚磷菌除磷能力的影響研究，但這些研究較少涉及不同聚磷菌在不同的厭氧時間條件下對好氧吸磷的相關(guān)作用.此外，諸如pH和有機(jī)質(zhì)分子大小等理化因素對聚磷菌聚磷能力的影響也已得到較深入研究. 然而，當(dāng)前的多數(shù)研究只局限于對單一因素的考察，抑或集中于研究高濃度廢水的生物處理系統(tǒng)，目前，聚磷微生物除磷工藝離工程應(yīng)用仍有較大的距離.正如研究表明，微生物的固定化能夠為其活性持留提供保障. 然而，考察固定化聚磷菌對含磷廢水的修復(fù)實驗尚未見相關(guān)報道. 因此，繼續(xù)篩選和開發(fā)具備高效除磷功能的微生物，開展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修復(fù)并開展綜合理化因素對聚磷微生物除磷能力的影響等方面的研究對工程實踐有重要指導(dǎo)意義.
鑒于此，本研究從排污口淤泥中篩選出1株具備高效除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素對菌株生長及除磷能力的影響. 同時，對微生物進(jìn)行固定化，并重點(diǎn)考察其對含磷廢水的凈化效果.
2 材料與方法
2.1 材料
2.1.1 樣品來源
淤泥樣品采自福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)高岐村某排污口，立即用于菌種的分離與篩選.
2.1.2 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、微量元素，以及缺磷培養(yǎng)基和富磷培養(yǎng)基分別按文獻(xiàn)進(jìn)行配制.LB培養(yǎng)基(g · L-1)：蛋白胨 10.00，酵母粉5.00，NaCl 10.00，瓊脂2.00(固基加入)，pH=7.2.固定化微生物小球?qū)嶒炁囵B(yǎng)基(g · L-1)：丁二酸鈉0.61，NaNO3 0.28，KH2PO4 0.1，KCl 0.014，MgSO4 · 7H2O 0.02，CaCl2 · 2H2O 0.018，pH =7.2.
以上所有培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃滅菌(碳源實驗中，葡萄糖和蔗糖組115 ℃滅菌)20 min后使用，微量元素于滅菌前加入.
2.1.3 微生物固定化小球制備材料
聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol，PVA)、海藻酸鹽(Sodium alginate，SA)、硼酸(H3BO3)、無水氯化鈣(CaCl2)，除硼酸(分析純)外其余均為化學(xué)純.
2.2 方法
2.2.1 聚磷菌的分離鑒定
稱取0.5 g新鮮淤泥，用無菌水水洗后8000 r · min-1離心5 min，棄上清，此過程重復(fù)3次. 處理后將樣品加入2.1.2節(jié)的富集培養(yǎng)基中，添加量及其他條件參考文獻(xiàn). 培養(yǎng)12 h后，取1.5 mL菌懸液于下一磷梯度的培養(yǎng)基中，磷梯度依次為2、5、8、10、15和20 mg · L-1(以P計).
聚磷菌含有典型的PHB顆粒和異染顆粒，經(jīng)強(qiáng)化釋磷、吸磷實驗后，PHB顆粒可被脂溶性染料蘇丹黑著色，異染顆粒可被甲苯胺藍(lán)和次甲基藍(lán)染成紫色，可與其他非顆粒性物質(zhì)區(qū)分開來. 將富集馴化的菌懸液按10-1~10-7梯度進(jìn)行稀釋，涂布平板. 挑取形態(tài)較特殊的單菌落進(jìn)行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，確定含有PHB顆粒和異染顆粒的菌落，進(jìn)行復(fù)篩實驗.
挑取經(jīng)純化的單菌落于缺磷培養(yǎng)基中，150 r · min-1、30 ℃培養(yǎng)12 h.將菌液在8000 r · min-1條件下離心5 min，再將菌液轉(zhuǎn)接于富磷培養(yǎng)基中，150 r · min-1、30 ℃培養(yǎng)至菌液變渾濁. 計算各株菌的除磷率.此后，將復(fù)篩得到的聚磷菌根據(jù)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行16S rRNA的測序及系統(tǒng)發(fā)育分析.
2.2.2 理化因素對聚磷菌生長及除磷特性的影響
聚磷菌具備高效除磷能力主要基于異染顆粒對磷的貯存，菌體在生長過程中也能夠利用部分磷合成細(xì)胞成分. 文獻(xiàn)報道顯示，聚磷菌在厭氧、缺磷條件下能夠把貯存于異染顆粒中的磷釋放出來，經(jīng)厭氧釋磷后將其投入富磷培養(yǎng)基中進(jìn)行除磷實驗?zāi)軌虼蟠筇岣叱啄芰? 此外，碳源、氮源、C/N、pH、溫度等都會影響聚磷菌的生長. 因此，考察不同理化因素對聚磷菌生長及除磷能力的影響是必要的，這對實現(xiàn)聚磷菌的工程應(yīng)用有重要參考價值.
將菌株ED-12于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h(30 ℃、150 r · min-1)，按5%的接種量接種于裝有30 mL缺磷培養(yǎng)基(PO3-4-P質(zhì)量濃度為12.3 mg · L-1)的150 mL三角瓶中，30 ℃、150 r · min-1搖瓶培養(yǎng)12 h;再按5%的接種量將菌懸液接種于裝有30 mL富磷培養(yǎng)基(PO3-4-P質(zhì)量濃度為32 mg · L-1)的150 mL三角瓶中，30 ℃、150 r · min-1搖瓶培養(yǎng). 每隔一定的時間取樣測定菌株ED-12的OD600及剩余的PO3-4-P濃度，計算除磷率并繪制菌株的生長曲線圖.
以聚磷菌的生長特性為基礎(chǔ)，以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為唯一氮源，同時考察了不同C/N、起始pH和搖床轉(zhuǎn)速對聚磷菌生長及除磷能力的影響.在優(yōu)化過程中，已優(yōu)化的參數(shù)作為后續(xù)實驗的條件.此外，在最優(yōu)條件下，探討了菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果，以考察其工程應(yīng)用價值. PO3-4-P的起始濃度梯度設(shè)置為：5、15、30、45、60和100 mg · L-1.
2.2.3 微生物固定化小球的制備及除氮磷初步實驗
微生物固定化小球的制備按以下步驟進(jìn)行：①稱取4 g PVA(聚合度1750±50)溶于90 mL無菌水中，待PVA充分溶解后加入2 g SA，沸水浴加熱至完全溶解，冷卻至室溫備用; ②分別稱取2 g反硝化菌和聚磷菌濕菌體，充分稀釋于10 mL無菌水中，再將稀釋后的菌液加入PVA-SA體系中，充分混勻;③根據(jù)需要的小球粒徑，剪去5 mL移液槍槍頭尖端，吸取菌體混合物，勻速滴入5%CaCl2-飽和硼酸溶液中，交聯(lián)15 min后，將小球用無菌水洗凈，備用.
以不添加菌球的組別為空白對照(Blank control)，以不添加微生物的固定化小球組為陽性對照(PVA+SA)，按5%(m/V，g · L-1)投加小球. 24 h后取樣測定水樣的TN和TP濃度，計算脫氮除磷能力.
2.3 測定方法
硝態(tài)氮(NO-3)和總氮(TN)的測定采用麝香草酚分光光度法，總磷(TP)的測定采用鉬銻抗分光光度法.
2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
運(yùn)用Microsoft Excel 2003和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及繪圖. 所有實驗均進(jìn)行3個重復(fù)，結(jié)果以Mean±SD表示.
3 結(jié)果與討論
3.1 聚磷菌的分離鑒定
3.1.1 聚磷菌的分離純化及復(fù)篩
經(jīng)富集，聚磷微生物在平板上的菌落隨著磷濃度的升高而減少，當(dāng)磷濃度達(dá)到20 mg · L-1時，平板上已無單菌落.將磷濃度為15 mg · L-1的培養(yǎng)基按10-1~10-7稀釋，涂布平板. 根據(jù)形態(tài)特征，將能夠在培養(yǎng)基上生長的49個單菌落分成4類，分別為EA(12株)、EB(15株)、EC(8株)和ED(14株). 分別對EA、EB、EC和ED進(jìn)行PHB顆粒染色和異染顆粒染色，初篩得到9個染色效果較明顯的聚磷菌單菌落(EA、EB和ED各3個，EC無受染現(xiàn)象).
隨后，對EA、EB和ED共9株聚磷菌進(jìn)行復(fù)篩實驗. 分別缺磷培養(yǎng)12 h后，轉(zhuǎn)接于富磷培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，測定除磷率，結(jié)果如表 1所示. 可知，ED-12對磷的去除能力最強(qiáng)，可達(dá)52.2%，因此，選擇菌株ED-12作進(jìn)一步研究.
表1 聚磷菌的除磷能力(起始濃度: 33.9 mg · L-1)
3.1.2 聚磷菌菌株ED-12的16S rRNA的PCR擴(kuò)增及序列分析
經(jīng)測序，獲得片段長度為1463 bp的部分16S rRNA基因序列，GenBank登錄號為JX966315. 在NCBI數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果表明，該菌株與Alicaligenes sp.的相似性達(dá)98%以上，推測其為Alicaligenes sp. 選擇序列相關(guān)性較高的76個16S rRNA序列，用Cluxtal X序列分析軟件分析其與ED-12的序列同源可靠性，選9個可信度較高的序列用MEGA 4.0軟件通過N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定ED-12的進(jìn)化地位，結(jié)果如圖 1所示.
圖 1 基于16S rRNA 序列同源性構(gòu)建的菌株ED-12和親緣性相近的其他細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹
3.2 ED-12的生長曲線及除磷特性
聚磷菌在缺氧、缺磷條件下會利用異染顆粒中的磷并合成PHB，將其轉(zhuǎn)入有氧、富磷的培養(yǎng)基后會將PHB中的能量釋放出來，以便更高效地聚磷，用于菌體生長并將剩余的磷儲存于異染顆粒中. 圖 2展示了菌株ED-12經(jīng)缺磷培養(yǎng)后在富磷培養(yǎng)基中的生長情況，以及其對PO3-4-P的去除率. 結(jié)果表明，在前16 h，菌體生長處于延滯期，16 h后進(jìn)入對數(shù)期，52 h后開始進(jìn)入衰亡期. 在整個過程中，菌體生長特征與除磷率趨勢基本吻合. 64 h內(nèi)，磷濃度從30 mg · L-1左右降低到(8.12±0.32)mg · L-1，去除率達(dá)73.82%±1.02%. 此后，總磷濃度基本保持不變.
圖 2 菌株ED-12的生長曲線及除磷特性
3.3 不同理化因素對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響 3.3.1 不同碳源對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
有機(jī)物特征是影響生物反應(yīng)器反硝化和除磷效果的重要因素，與反硝化微生物類似，大部分聚磷菌只能以低級脂肪酸類的小分子有機(jī)基質(zhì)作為碳源，并將其合成的PHB以能量形式儲存在細(xì)胞內(nèi).
以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖和蔗糖為碳源，菌株ED-12的生長及除磷能力結(jié)果如圖 3所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖為碳源時基本不生長，對PO3-4-P的去除率低于15%. 而菌株在以乙酸鈉、丁二酸鈉、檸檬酸鈉為碳源時長勢較好，且對PO3-4-P的去除率都在50%以上. 其中，以乙酸鈉為碳源時，菌株ED-12生長最旺盛，對PO3-4-P的去除率達(dá)到了70%以上. 對比5種碳源結(jié)構(gòu)與分子量，相對而言，在分子結(jié)構(gòu)簡單、分子量低的情況下，聚磷菌的生長較好，且能達(dá)到一個較高的除磷率，這與前述觀點(diǎn)相符. 此外，聚磷菌對不同碳源的利用效果可能還與其本身對碳源的親和性或其他特性有關(guān).
圖 3 不同碳源對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.2 不同氮源對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
氮源是微生物細(xì)胞生長的第二大營養(yǎng)物質(zhì)，對蛋白質(zhì)、核酸和其他一些成分的合成非常重要. 多數(shù)細(xì)菌能以氨鹽作為唯一氮源，由圖 4可知，在以NH4Cl、(NH4)2SO4和NH4NO3為唯一氮源的培養(yǎng)基中，聚磷菌能夠良好生長. 其中，在含有NH4Cl的培養(yǎng)基中OD600可在24 h內(nèi)達(dá)到1.4左右. 同時，在以上3種氮源培養(yǎng)基中，菌株ED-12對PO3-4-P的去除率都在45%以上(NH4Cl培養(yǎng)基最高，可達(dá)80%). 觀察發(fā)現(xiàn)，菌株ED-12在24 h時，在以NaNO3和NaNO2為唯一氮源的培養(yǎng)基中只能微弱的生長，但經(jīng)48 h的培養(yǎng)后，開始進(jìn)入對數(shù)期，并能達(dá)到較高的OD600. 此外，雖然以NaNO3和NaNO2為唯一氮源時微生物生長情況較差，但培養(yǎng)基中PO3-4-P濃度分別降低了63.72%±5.57%和34.84%±2.11%，說明微生物在24 h內(nèi)主要通過分解PHB并將磷儲存于異染顆粒中在后期用于菌體的生長. 但研究認(rèn)為，NO-2的存在在有氧和無氧兩種情況下都會抑制聚磷菌對磷的吸收. 圖 4得出了不同的結(jié)論，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究. 在以蛋白胨為唯一氮源的培養(yǎng)基中，菌株ED-12長勢較好，但蛋白胨含有含磷雜質(zhì)，因而影響了PO3-4-P去除率的計算.
圖 4 不同氮源對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
由此可知，聚磷菌ED-12菌株能夠在以NH4Cl、NaNO3、NaNO2、(NH4)2SO4、蛋白胨和NH4NO3為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長.根據(jù)微生物生長量、生長周期及對PO3-4-P的去除率，NH4Cl是菌株ED-12生長及發(fā)揮除磷能力的最佳氮源.
3.3.3 不同C/N對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
碳源和氮源是微生物生長的重要物質(zhì)，不同微生物對碳源和氮源的需求量不同. 細(xì)菌對氮源的需求量大，真菌和放線菌等對碳源的需求量大. 在脫氮除磷工藝中，必須考慮C/N以實現(xiàn)微生物對廢水中氮、磷的有效利用.
考察C/N對聚磷菌ED-12菌株生長及除磷能力的影響，結(jié)果(圖 5)表明，隨著C/N的升高，菌體生物量增大，同時對PO3-4-P的去除率也隨之提高，C/N為3 ∶ 1時達(dá)到最大值. 此后，微生物的生長及對PO3-4-P的去除率又隨著C/N的升高而緩慢降低，說明過高的C/N導(dǎo)致氮源不足，微生物生長也因此受到了抑制.
圖 5 不同C/N對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.4 不同pH對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
在好氧條件下，聚磷菌能分別以醋酸和PO3-4為碳源和磷源，生成聚合態(tài)磷作為儲能物質(zhì)，儲存于細(xì)胞內(nèi)并伴隨著產(chǎn)生OH-，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值逐漸升高. 其聚磷過程可用式(1)表示.
圖 6 不同起始pH對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.5 不同溫度對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
溫度是除有機(jī)物特征外影響微生物生長的另一重要因素，但王亞宜等(2006)和姜體勝等(2007)認(rèn)為，溫度不會影響聚磷菌發(fā)揮聚磷作用.
由圖 7可知，隨著溫度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，35 ℃時最適宜ED-12菌株的生長. 相應(yīng)地，ED-12菌株對PO3-4-P的去除率也呈先增后減的趨勢，在35 ℃時達(dá)到最大值(73.14%±1.65%). 由此可知，不同溫度對聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影響比對其生長的影響大得多.溫度對聚磷效果存在影響，這與Panswad等(2003)的研究結(jié)果相符，即35 ℃最有利于聚磷菌發(fā)揮聚磷作用，過高或過低的溫度都會抑制其效果，說明不同的微生物聚磷特性存在差異.
圖 7 不同溫度對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
3.3.6 不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株ED-12的生長及除磷能力的影響
研究表明，溶氧是影響生物除磷效果的一個重要因素. 為了滿足聚磷菌生物膜內(nèi)對氧的需求量，加快氧的傳遞速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必須提高液相主體中溶解氧的含量. 此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷(在含硝酸鹽或亞硝酸鹽培養(yǎng)中可以進(jìn)行厭氧生長).
如圖 8所示，搖床轉(zhuǎn)速在0~200 r · min-1之間，菌株ED-12都能生長. 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r · min-1時，菌體OD600最高，達(dá)2.60±0.62;當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r · min-1時，對PO3-4-P的去除率最高，達(dá)59.05%±7.26%. 在各培養(yǎng)條件下，菌體的生長與除磷率趨勢不盡相同，說明二者是彼此獨(dú)立的過程.靜置培養(yǎng)時，儲存于異染顆粒的磷被分解，用于菌體的生長，此時對PO3-4-P的去除率近50%，說明菌株ED-12在厭氧條件下還能將環(huán)境中的磷用于生長. 好氧條件下，菌體將部分磷用于生長，并將剩余的磷儲存于異染顆粒中，因此，在轉(zhuǎn)速≥50 r · min-1時也能維持一個較高的除磷率. 觀察發(fā)現(xiàn)，搖床轉(zhuǎn)速過高未必能提高除磷率.
圖 8 不同搖床轉(zhuǎn)速對菌株ED-12生長及除磷能力的影響
微生物固定化小球脫氮除磷實驗表明(詳見3.5節(jié))，ED-12菌株在低溶氧與高溶氧時都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的強(qiáng)弱導(dǎo)致了圖 8所示的結(jié)果，即高溶氧時對PO3-4-P的去除率與低溶氧時相近. 當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r · min-1時，培養(yǎng)基中的溶氧最適合ED-12菌株對磷的反硝化去除或儲存于異染顆粒中.低溶氧和高溶氧條件下，則分別表現(xiàn)為對磷的生長利用和積聚. 因此，對廢水中的磷的有效去除可以通過調(diào)節(jié)溶氧而實現(xiàn)，此過程包括生長利用和聚磷作用.
3.4 菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
聚磷菌對磷的去除包括兩條途徑：生長利用和異染顆粒貯磷.根據(jù)聚磷菌分離篩選原理，過高濃度的PO3-4-P會抑制聚磷菌的生長與繁殖. 因此，考察不同起始濃度的PO3-4-P對聚磷菌生長的影響及相應(yīng)條件下聚磷菌對PO3-4-P的去除效果，對分析聚磷菌生長與聚磷過程的關(guān)系及指導(dǎo)聚磷菌在富營養(yǎng)化水體中的工程應(yīng)用有實際意義.
如圖 9所示，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12的OD600呈先增后減的趨勢. 當(dāng)PO3-4-P濃度為45 mg · L-1時，菌株ED-12的長勢最好，過高的PO3-4-P反而會抑制菌體的生長.這是由于微生物生長受到了基質(zhì)自抑制作用，這與聚磷菌分離篩選的結(jié)論相符. 觀察發(fā)現(xiàn)，除5 mg · L-1組，隨著PO3-4-P濃度的升高，菌株ED-12對PO3-4-P的去除率與聚磷菌生物量成正相關(guān)(圖中未顯示)，但PO3-4-P的變化濃度始終呈一遞增趨勢. 當(dāng)PO3-4-P濃度>45 mg · L-1時，培養(yǎng)基中出現(xiàn)了部分沉淀物. 正如3.3.4節(jié)的結(jié)論，聚磷過程會釋放OH-，微生物生長越快，在相同的時間內(nèi)產(chǎn)生的OH-也越多，因此，就有越多的PO3-4-P形成了沉淀，這合理地解釋了以上的現(xiàn)象.以上結(jié)論說明，Alcaligenes sp. ED-12對磷的吸收是一個復(fù)雜的過程，在菌體生長及聚磷過程中，不僅會受理化因素尤其是pH的影響，溶液中的磷濃度也是影響聚磷菌生長與聚磷效果的一個關(guān)鍵因素. 由以上分析可知，菌株ED-12對PO3-4-P的去除能力很強(qiáng)，在不同PO3-4-P起始濃度梯度條件下，最高去除率可達(dá)81.02%±2.27%，此時的PO3-4-P濃度變化量為(36.46±1.02)mg · L-1.
圖 9 菌株ED-12對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果
表 2所示為典型的聚磷菌對不同起始濃度PO3-4-P的去除效果. 由表可知，除耳葡萄球菌(Staphyloccocus auricularis)、Accumulibacter和Competibacter外，其他菌株對濃度<50 mg · L-1的PO3-4-P去除效果一般. 在當(dāng)前所報道的產(chǎn)堿桿菌除磷能力實驗中，都未開展磷濃度梯度實驗;除Bao等(2007)的報道外，其余產(chǎn)堿桿菌菌株對濃度<30 mg · L-1的PO3-4-P去除效果都低于90%. 本研究所得菌株不僅在磷濃度為45 mg · L-1時具有較高的去除率，當(dāng)濃度高達(dá)60 mg · L-1甚至100 mg · L-1時還能維持較高的活性及去除率. 因此，菌株ED-12是一株較理想的聚磷菌，具有廣闊的應(yīng)用前景. 然而，微生物聚磷過程比較復(fù)雜，今后的研究工作可圍繞精確定量菌株Alcaligenes sp. ED-12的磷吸收在生長利用及貯存方面的比例及吸收與釋放的關(guān)系上.
表2 不同微生物對磷的去除效率
微生物PO3-4-P起始濃度/
(mg·L-1)PO3-4-P去除率參考文獻(xiàn)
金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)1065%南亞萍等，2013
耳葡萄球菌(Staphyloccocus auricularis)50>90%Choi et al., 2000
腸桿菌(Enterobacter sp.)10.2594.6%張培玉等，2011
Accumulibacter & Competibacter53.3>80%Oehmen et al., 2005
克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)27<80%趙海泉等，2009
約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)1065.24%連麗麗，2009
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)7.590%劉亞男等，2005
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)10>90%Bao et al., 2007
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)20.2582.3%孫夢，2011
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)28.7377.1%焦中志等，2009
產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)4581%本研究
3.5 固定化聚磷微生物小球除氮磷實驗
微生物的固定化是實現(xiàn)微生物活性持留的途徑之一，同時，固定化也有助于目標(biāo)微生物的投加與回收. 當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的固定化材料是聚乙烯醇和海藻酸鹽，固定化交聯(lián)劑通常選擇2%~5%的CaCl2-飽和硼酸溶液.
根據(jù)賴子尼等(2008)的實驗配方制備的固定化聚磷微生物小球的彈性與機(jī)械強(qiáng)度較好，對含氮磷廢水的凈化效果表明，菌球?qū)α子休^強(qiáng)的去除能力(從(19.91±1.81)mg · L-1 降至(6.19±0.76)mg · L-1)，同時能夠去除一定的氮(從(215.82±35.29)mg · L-1 降至(183.42±15.35)mg · L-1)(圖 10 a). 二者的去除率分別達(dá)56.21%和15.01%(圖 10 b). 其中，固定化材料對氮的吸附比例較小，而對磷的吸附較顯著(p<0.01)，這可能與固定化材料的表面官能團(tuán)及CaCl2等對PO3-4的親和力強(qiáng)于NO-3有關(guān). 同時，固定化微生物(IMOs)對磷的去除效果也優(yōu)于氮，說明菌株ED-12可能不具備反硝化能力，對氮的利用僅是生長所需. 由PVA+SA+IMOs組與PVA+SA組比較可知(圖 10b，#表示)，無論是氮還是磷，都存在顯著差異，說明固定化微生物是氮磷去除的主要貢獻(xiàn)者.
圖 10 固定化聚磷微生物小球?qū)Φ椎娜コЧ?/p>
4 結(jié)論
1)本研究成功從高岐村某排污口篩選出1株典型的聚磷微生物，鑒定發(fā)現(xiàn)其屬于產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes sp.)細(xì)菌，將其命名為Alcaligenes sp. ZGED-12.
2)研究發(fā)現(xiàn)，菌株ED-12能在高磷濃度下生長，16 h時進(jìn)入生長對數(shù)期. 理化因素實驗確定了聚磷菌ED-12的最適生長及發(fā)揮除磷能力的條件，其中，碳源、氮源和pH對其影響最大.磷濃度實驗表明，低濃度磷不利于菌株ED-12的生長，但過高濃度反而會抑制菌體生長及發(fā)揮聚磷功能，最優(yōu)磷濃度為45 mg · L-1.
3)本研究成功實現(xiàn)了聚磷微生物的固定化，該固定化小球?qū)Φ椎娜コ@示出了良好的效果，作用機(jī)理包括固定化材料對氮磷的物理化學(xué)吸附及微生物的吸收利用(或貯存). 其中，微生物在這個過程中起著關(guān)鍵作用.
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