水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象已成為世界上重要的水環(huán)境污染問(wèn)題，富營(yíng)養(yǎng)化通常指在人類活動(dòng)的影響下，生活污水、化肥和食品等工業(yè)廢水、降水以及地表徑流中含有的大量氮、磷及其他無(wú)機(jī)鹽等植物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸入水庫(kù)、湖泊、河流等緩流水體后，引起藻類及其他浮游生物的迅速繁殖，水體溶解氧下降，水質(zhì)惡化，魚(yú)類及其他生物大量死亡的現(xiàn)象。隨著工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的迅速發(fā)展，人類每天向自然界中排放大量富含氮磷的工業(yè)廢水，這些廢水如不經(jīng)過(guò)處理排入水體中，就增加了水體中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的負(fù)荷量，導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化
目前，我國(guó)許多食品企業(yè)存在規(guī)模小、技術(shù)落后、廢水排放量大等問(wèn)題，而企業(yè)又無(wú)能力建設(shè)符合標(biāo)準(zhǔn)的環(huán)保處理裝置，其直接后果就是將廢水直接排放，污染江河湖海水體環(huán)境。以豆瓣企業(yè)為例，每年排放的廢水超過(guò)1.3億噸，而且傳統(tǒng)的豆瓣企業(yè)都是從家庭作坊式發(fā)展起來(lái)的，有廢水處理裝置的企業(yè)不多，因此在傳統(tǒng)企業(yè)向現(xiàn)代化企業(yè)轉(zhuǎn)型的過(guò)程中，豆瓣企業(yè)的廢水處理的環(huán)保處理裝置和技術(shù)也需要轉(zhuǎn)型。研究發(fā)現(xiàn)食品企業(yè)的廢水中有機(jī)物含量比較高，經(jīng)過(guò)物理、化學(xué)等方法多級(jí)處理后，剩下高濃度氨氮的廢水處理最經(jīng)濟(jì)有效的方法為微生物降解處理，其核心問(wèn)題在于微生物菌種。因此，本文從豆瓣企業(yè)污水中篩選高效降解氨氮的土著微生物菌種，制作微生物菌劑，通過(guò)微生物強(qiáng)化技術(shù)解決豆瓣企業(yè)等食品企業(yè)的污水處理問(wèn)題。
一、材料與方法
1.1 樣品
分別從鵑城、丹丹、揚(yáng)名食品、清香園等四川省著名品牌的豆瓣生產(chǎn)企業(yè)采集生產(chǎn)污水，采用微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)分離、篩選其中的土著微生物作為氨氮降解實(shí)驗(yàn)研究的出發(fā)菌種。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、六水合氯化亞鐵、氯化鈣、七水合硫酸鎂、琥珀酸鈉、酵母浸出物、硫酸鋅、氫氧化鈉、鹽酸、氧化鎂、溴百里酚藍(lán)、硼酸、甲基紅、甲基橙、亞甲藍(lán)、碳酸鈉，以上試劑均為分析純。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
三角瓶、燒杯、試管、容量瓶、平板、移液器槍頭、移液器、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、搖床、分光光度計(jì)、凱氏燒瓶、直形冷凝管、酸堿滴定臺(tái)、離心機(jī)、干燥箱、電磁爐、電子天平、真空冷凍干燥機(jī)
1.4 培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。
分離培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化鈉5g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂18-20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min。
種子培養(yǎng)基：硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，六水合氯化亞鐵0.5g/L，氯化鈣0.2g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉8.5g/L，121℃滅菌20min。
發(fā)酵培養(yǎng)基：硫酸銨3.9g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃滅菌20min。
1.5 分離方法
1.5.1 微生物菌種的富集
按照5%的比例取混合均勻的水樣加入富集培養(yǎng)基中，28-30℃、180r/min搖床富集培養(yǎng)18-24h。
1.5.2 微生物菌種的分離、篩選
吸取上一步富集好的菌液，采用梯度稀釋的方法接種于分離平板上，28-30℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，待單菌落長(zhǎng)出，挑選形態(tài)差異的單菌落且在新的培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)挑單菌落和平板劃線的操作，直至單菌落為一種微生物，挑選單菌落接斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)、保藏。
1.5.3 微生物菌種的保藏
對(duì)篩選到的菌種進(jìn)行編號(hào)，制作真空冷凍干燥管保藏。
1.6 微生物發(fā)酵
種子培養(yǎng)基：挑選斜面培養(yǎng)的單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，于28-30℃、180r/min條件下?lián)u床中震蕩培養(yǎng)18-24h，繪制其生長(zhǎng)曲線。
發(fā)酵培養(yǎng)基：接種活化好的種子菌液，于搖床中震蕩培養(yǎng)。分別對(duì)菌種、接種量、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速(通氧量)等單因素條件進(jìn)行優(yōu)化。挑選氨氮降解性能優(yōu)良的土著微生物菌種，按不同比例混合進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵條件。
1.7 水質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)
測(cè)定氨氮的方法主要為納氏比色法和蒸餾—酸滴定法，本文采用蒸餾—酸滴定法測(cè)定微生物對(duì)氨氮的降解效果。
二、結(jié)果與分析
2.1 不同豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水的指標(biāo)差異分析
從鵑城、丹丹、揚(yáng)名食品、清香園等四川省著名品牌的豆瓣生產(chǎn)企業(yè)采集生產(chǎn)污水樣品，分別命名為JC、DD、YM、QXY。依次檢測(cè)4種水樣的pH值、氨氮濃度、TP濃度、COD值等指標(biāo)，為模擬實(shí)驗(yàn)環(huán)境下污水的水質(zhì)條件，進(jìn)行微生物菌種的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以及對(duì)篩選的菌種進(jìn)行馴化。從表1可以看出，豆瓣企業(yè)的生產(chǎn)污水的幾個(gè)主要污染指標(biāo)分別為：pH值5-7，氨氮濃度0.1-1.0g/L，TP濃度0.1-1.0g/L，COD濃度3.0-10.0g/L。以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)豆瓣土著微生物菌種的發(fā)酵培養(yǎng)基為：硫酸銨3.9g/L，磷酸二氫鉀1g/L，七水合硫酸鎂1g/L，琥珀酸鈉2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃滅菌20min。
2.2 不同豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水中土著微生物的差異分析
選取進(jìn)入中國(guó)地理標(biāo)志品牌的郫縣豆瓣品牌企業(yè)作為研究對(duì)象，分別從郫縣鵑城豆瓣有限公司(鵑城)、四川省丹丹郫縣豆瓣集團(tuán)股份有限公司(丹丹)、成都揚(yáng)名食品有限公司(揚(yáng)名食品)和四川清香園調(diào)味品有限公司(清香園)收集生產(chǎn)污水水樣，包括污水處理池進(jìn)水、曝氣池、厭氧池、出水等水樣各3份。采用傳統(tǒng)的梯度稀釋、平板分離的方法，共收集70多株微生物菌株。經(jīng)過(guò)光學(xué)形態(tài)鑒定和16SrDNA分子鑒定，如表2和圖1中結(jié)果，鵑城、丹丹、揚(yáng)名食品、清香園生產(chǎn)污水中的微生物數(shù)量分別為15種、19種、17種和14種，其中芽孢桿菌屬占比最大。
2.3 土著微生物發(fā)酵降解氨氮實(shí)驗(yàn)
根據(jù)發(fā)酵預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，挑選了JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等共5株氨氮降解效果好的土著微生物菌種作為出發(fā)菌種，繪制其生長(zhǎng)曲線，如圖2所示，5株土著微生物菌種的活化種子液濃度都是在10-15h之間達(dá)到最大值，以此活化土著微生物菌種，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。
由表3可知，篩選的JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌種發(fā)酵降解氨氮的效果比較顯著，預(yù)實(shí)驗(yàn)條件下的氨氮降解率都在80%及以上，經(jīng)過(guò)16SrDNA分子生物學(xué)鑒定，分別為解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌、纖維素菌屬、地衣芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬。由圖3可知，土著微生物的降解氨氮效果大多數(shù)比較低，基本上都小于70%，離項(xiàng)目預(yù)期應(yīng)用的90%降解率還有一定距離，因此，對(duì)5種土著微生物菌種進(jìn)行協(xié)調(diào)發(fā)酵，探索復(fù)合菌劑發(fā)酵對(duì)氨氮降解效果的影響。
2.4 復(fù)合微生物菌劑提高降解氨氮效果實(shí)驗(yàn)初探
由表4和圖4可知由JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌種按照1∶1∶1∶1∶1比例混合的復(fù)合微生物菌劑F1，其發(fā)酵降解氨氮的效果較之前的單一菌種發(fā)酵有顯著的提高，氨氮降解率達(dá)到93.75%，分別較單一菌種發(fā)酵降解氨氮的效率提高了8%、32%、65%、15%和24%。
三、結(jié)論
從豆瓣企業(yè)生產(chǎn)污水中分離、篩選的解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌、纖維素菌屬、地衣芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌屬和假單胞菌屬等5株土著微生物菌株，編號(hào)分別為JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3，都具有顯著的氨氮降解效果，但離工業(yè)化污水處理菌劑還有差距，以該5株土著微生物菌種開(kāi)發(fā)的復(fù)合微生物菌劑在氨氮降解效果上有明顯的改善，氨氮降解率達(dá)到93.75%，具有很好的應(yīng)用潛力。（ >
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