一、前言
目前，我國啤酒工業(yè)發(fā)展迅速，啤酒產(chǎn)量不斷增加，與此同時啤酒廢水的產(chǎn)生量也是逐年增加，例如，2002年我國啤酒廢水的排放量為2.7億桿，占全國工業(yè)廢水排放總量的1.3%。啤酒生產(chǎn)經(jīng)歷制麥、糖化、發(fā)酵、罐裝等多道工序，產(chǎn)出廢水包括糖化廢水、洗滌廢水、廢酵母液和冷卻廢水等，一般每生產(chǎn)1t啤酒產(chǎn)生3-10t啤酒廢水。雖然啤酒廢水無毒，但是直接排放仍然會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，如何能高效低能耗地處理發(fā)酵類型廢水成為備受關(guān)注的環(huán)境問題之一。啤酒廢水的主要成分有大量的淀粉、蛋白質(zhì)、殘余啤酒以及洗滌用堿，其COD—般在2000-4000mg/L。由于啤酒廢水的可生化性較高，目前主要采用生物處理法處理，最常見的是厭氧與好氧聯(lián)合生物處理法
厭氧生物處理技術(shù)具有污泥產(chǎn)率低、容積負(fù)荷高、運行穩(wěn)定性強、能耗低、可回收清潔能源和運行管理費用低等特點，因而被廣泛推廣與應(yīng)用。目前厭氧反應(yīng)器形式主要包括厭氧過濾器(AF)、厭氧流化床反應(yīng)器(AFBR)、上流式厭氧污泥床反應(yīng)器(UASB)、膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器(EGSB)和內(nèi)循環(huán)厭氧反應(yīng)器(IC)。IC反應(yīng)器是由上下兩個UASB反應(yīng)器串聯(lián)組合而成，上部是低負(fù)荷區(qū)，底部是高負(fù)荷區(qū)，通過沼氣上升的方式使泥水充分混合。由于處理效果好、管理方便、運行穩(wěn)定，特別適用于處理高濃度的有機廢水，因而被廣泛應(yīng)用在啤酒廢水處理中，取得了較好的處理效果。本啤酒廠廢水的厭氧生物處理主要采用IC工藝，Q反應(yīng)器對廢水COD的去除率達(dá)到了80%。在廢水的生物厭氧處理系統(tǒng)中，微生物多樣性對廢水處理效果的影響最為直接，為了更進(jìn)一步了解廢水處理過程的內(nèi)在機制，有必要對啤酒廢水主要工藝的微生物區(qū)系進(jìn)行研究，并對厭氧污泥中的優(yōu)勢功能微生物進(jìn)行分離鑒定。
二、材料和方法
2.1污泥及廢水的采集
啤酒廢水取自啤酒廠廢水處理調(diào)節(jié)池。經(jīng)測定，該廢水具有高COD和低氨氮的特點。以所取厭氧污泥為接種物，對該污泥進(jìn)行微生物多樣性的分析，并從中分離功能微生物。
2.2厭氧污泥微生物多樣性分析
微生物的全基因組采用DNA提取試劑盒(北京莊盟)進(jìn)行提取。以提取的基因組為模板，以通用引物515F/806R(515F：5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3';806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')擴增16SrRNA基因的V4區(qū)。將擴增的樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，利用IlluminaMiSeq測序平臺進(jìn)行測序和微生物多樣性分析。
2.3優(yōu)勢功能微生物分離篩選
直接向啤酒廢水中加入(/L)：NH4CI.25g，NaH2PO4，2H2O0.08g和NaHPO40.25g，利用高壓蒸汽滅菌(121°C，20min)后作為微生物分離鑒定及培養(yǎng)的培養(yǎng)基。利用高純氮對培養(yǎng)基進(jìn)行充氣，以去除培養(yǎng)基中的氧氣。采用液體稀釋法分離厭氧污泥中的優(yōu)勢功能微生物：稱取0.1g污泥介入上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d作為接種物;將接種物在新鮮液體培養(yǎng)基中進(jìn)行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配到w1個微生物。如果經(jīng)稀釋后的大多數(shù)試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。如果經(jīng)稀釋后的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養(yǎng)物的幾率就會急劇下降。因此，采用稀釋法進(jìn)行液體分離，必須在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數(shù)(一般應(yīng)超過95%)表現(xiàn)為不生長。經(jīng)過多輪的稀釋得到純培養(yǎng)的微生物，即為厭氧污泥中的優(yōu)勢功能微生物。
2.4微生物鑒定
使用細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒提取所分離出的細(xì)菌的基因組。以細(xì)菌基因組為模板，利用細(xì)菌16srRNA基因擴增通用引物27f和1492r，27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。Per擴增反應(yīng)的條件：95℃的條件下預(yù)變性6min，95°C的條件下變性45s，55°C的條件下退火45S，72°C的條件下延伸90s，第二步到第五步循環(huán)30次，72°C的條件下延伸10min，per反應(yīng)結(jié)束4°C下保存。擴增成功后得到的樣品需送往華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，16srRNA基因的測序引物和擴增引物相同。利用BLASTN程序?qū)y出的基因序列與已承認(rèn)的所有已知細(xì)菌的16srRNA基因進(jìn)行比對(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，獲得所測序列與已知序列之間的相似性數(shù)據(jù)。獲得相似度較高的序列之后，利用mega7.0對所獲得的每種基因的序列進(jìn)行多序列比對，利用多序列比對的結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹⑷。通常采用鄰接法、最大似然法和最大簡約法構(gòu)建進(jìn)化樹，其中鄰接法最常用，自展值常設(shè)定為重復(fù)1000次計算。
2.5廢水分析方法
啤酒廢水及出水樣品指標(biāo)利用化學(xué)需氧量(COD)以及乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量來表征。COD測定：樣品用Milli-Q水稀釋10倍后COD快速測定儀(5BT型COD快速測定儀，連華科技，中國)測定COD。
樣品經(jīng)12000xg離心2min后取上清液過0.22pm濾膜，用于乙酸、丙酸、乳酸和乙醇含量測定。乙酸、丙酸采用高效液相色譜儀(島津LC-20AT，島津，日本)測定。色譜條件：島津C18柱(4.6x150nm，5pm);流動相：48rnM磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.15);柱溫：30°C;進(jìn)樣量10[1L;流速1.0mL/min;檢測波長210nm。乳酸采用高效液相色譜儀(島津LC-20AT，島津，日本)測定。色譜條件：島津C18柱(4.6x250nm，5pm);流動相：0.1%磷酸水溶液：乙月青=98：2(V：V);柱溫：35°C;進(jìn)樣量100mL;流速1.0mL/min;檢測波長210nm。
乙醇采用配有FID檢測器氣相色譜儀(Agilent7890A，Agilent，USA)、頂空進(jìn)樣器(Agilent7697A，Agilent，USA)、OV-1毛細(xì)管柱(30mx0.32mmx0.25mm)測定。頂空進(jìn)樣器條件：平衡溫度80t;定量管溫度：95匸;傳輸線溫度：95°C;平衡時間：10nnin;進(jìn)樣量：1.0mL。色譜條件：進(jìn)樣器溫度：150°C;柱溫箱溫度：60°C;FID檢測器溫度：300°C;載氣為高純氮，柱流量50mL/min;氫氣流量50mL/min;助燃空氣流量350mL/min;清掃40mL/min;尾吹10mL/min;分流比為25：4。
三、結(jié)果與討論
3.1微生物多樣性分析
對污泥所包含的微生物種類及數(shù)量進(jìn)行分析，按照占比排序位于前十名的微生物如圖1所示。結(jié)果表明，污泥中包含大量未經(jīng)鑒定的新型微生物，約占微生物總量的30%，此外還有(按照豐度順序排列)：Syntrophobacterspp.(17.4%)，Methanobacteriumspp.(7.3%)，Geobacterspp.(1.5%)，Enterococcusspp.(0.9%)，Veilonellaspp.(0.7%)，Prevotellaspp.(0.7%)，Acinetobacterspp.(0.5%)，Desulfovibriospp.(0.3%)，Zoogloeaspp.(0.2%)和Streptococcusspp.(0.2%)„按照文獻(xiàn)報道，Syntrophobacter是一類互營微生物，可以在多種互營體系中降解丙酸，Methanobacterium是已知的很重要的一類產(chǎn)甲烷菌，可以利用乙酸或者二氧化碳產(chǎn)生甲烷，這可能是厭氧污泥產(chǎn)沼氣的重要功能微生物問，而Geobacter可以降解乙醇和乙酸等多種簡單化合物，而且可以和Methanobacterium互營生長。
3.2優(yōu)勢功能微生物分離鑒定
利用梯度稀釋法從厭氧污泥中分離到了一株優(yōu)勢功能微生物，將其命名為ZX—菌株。將分離的優(yōu)勢功能微生物進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果顯示菌株ZX-1與已知的GeobactermetallireducensGS-15的16SrRNA基因相似度為99.4%。系統(tǒng)分類學(xué)結(jié)果顯示，菌株ZX-1與G.metallireducensGS-15進(jìn)化關(guān)系最近(圖2)。根據(jù)文獻(xiàn)報道，GeobactermetallireducensGST5可以降解乙酸、乙醇和苯甲酸等多種有機物，是一種重要的功能微生物。本實驗沒有分離出污泥中豐度更高的Syntrophobacter和Methanobacterium可能是因為前者需要和其他微生物進(jìn)行互營生長很難獲得純培養(yǎng)物而后者是產(chǎn)甲烷菌，需要及其苛刻的厭氧條件因而也很難分離。
3.3菌株ZX-1對啤酒廢水處理效果分析
經(jīng)測定，啤酒廢水的COD約為3000mg/L，包含乙酸850mg/L，丙酸400mg/L，乙醇80mg/L和乳酸700mg/L等多種物質(zhì)。為了分析菌株ZX-1對啤酒廢水的處理效果，向啤酒廢水中加入磷酸鹽和氮源(具體見材料與方法)后作為菌株ZX-1的培養(yǎng)基。按照10%的接種量將菌株ZX-1的種子液接入100ml新配置的培養(yǎng)基中，并于30°C進(jìn)行培養(yǎng)。每天監(jiān)測廢水中COD及上述各物質(zhì)的含量。
如圖3所示，經(jīng)過了1天的適應(yīng)期后，啤酒廢水中的COD開始下降，10天后COD降至約1000mg/L，并維持穩(wěn)定。可見菌株DX-1可去除廢水中約67%的COD„在相同的時間內(nèi)，厭氧污泥對啤酒廢水COD的去除率可以高達(dá)90%，菌株ZX-1無法達(dá)到厭氧污泥的COD去除率，這可能是由于厭氧污泥中的其他微生物，女DAcinebacter和Zoogloea等，可以徹底降解丙酸和乳酸，而菌株ZX-4無法降解丙酸和乳酸導(dǎo)致的(數(shù)據(jù)未顯示)。
如圖4和圖5所示，菌株ZX-1可在十天內(nèi)完全降解廢水中的乙酸和乙醇，而厭氧污泥可在5天內(nèi)完全降解廢水中的乙酸和乙醇。這是由于，在厭氧污泥中，除了Geobacter菌之外，其他種類的微生物也在發(fā)揮著降解乙酸和乙醇的作用。
四、結(jié)論
(1)對該厭氧污泥的微生物群落分析結(jié)果表明，污泥中包含大約30%未經(jīng)鑒定的新型微生物，此外占比超過1%的微生物類群還包括Syntrophobacter(17.4%)，Methanobacterium(7.3%)和Geobacter(1.5%)。
(2)從厭氧污泥中分離到了一株優(yōu)勢功能微生物，命名為ZX-1o經(jīng)鑒定ZX-1屬于Geobacter屬。菌種ZX-1對啤酒廢水的COD去除效率可達(dá)到67%，可徹底降解廢水中的乙酸和乙醇。( >
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